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ELISA雙抗體夾心法關(guān)鍵步驟詳解
以下是本生技術(shù)小編對(duì)ELISA雙抗體夾心法的關(guān)鍵步驟詳解，結(jié)合操作要點(diǎn)和注意事項(xiàng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)化說(shuō)明：
一、實(shí)驗(yàn)原理概述?
雙抗體夾心法通過(guò)?兩種特異性抗體?(包被抗體和酶標(biāo)抗體)結(jié)合抗原的不同表位，形成“夾心"結(jié)構(gòu)，最終通過(guò)酶催化底物顯色實(shí)現(xiàn)定量分析?。適用于檢測(cè)二價(jià)或以上大分子抗原?。
二、關(guān)鍵操作步驟?
1. ?包被抗體?
固相載體準(zhǔn)備?：選擇聚苯乙烯酶標(biāo)板(需驗(yàn)證蛋白結(jié)合能力)，pH 9.0-9.6緩沖液稀釋抗體至濃度(需預(yù)實(shí)驗(yàn)滴定)?。
包被條件?：4℃過(guò)夜孵育或37℃ 2小時(shí)，確?？贵w充分結(jié)合?。
2. ?封閉未結(jié)合位點(diǎn)?
使用1-5% BSA或脫脂牛奶封閉，37℃孵育1小時(shí)，減少非特異性吸附?。
3. ?加樣與孵育?
標(biāo)準(zhǔn)品/樣本?：每孔加入100μL，37℃孵育1小時(shí)，確?？乖c包被抗體結(jié)合?。
洗滌?：PBS洗滌4-6次，每次30秒，拍干后保持孔內(nèi)濕潤(rùn)?。
4. ?酶標(biāo)抗體反應(yīng)?
加入生物素化抗體(與包被抗體結(jié)合不同抗原表位)，37℃孵育1小時(shí)?。
再次洗滌后，加入HRP-鏈霉親和素(若使用信號(hào)放大系統(tǒng))?。
5. ?顯色與終止?
加入TMB底物，避光孵育15-30分鐘，觀察梯度顯色?。
加入2Mliusuan終止反應(yīng)，藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色?。
三、注意事項(xiàng)?
抗體配對(duì)?：包被抗體與酶標(biāo)抗體需識(shí)別抗原不同表位，避免交叉反應(yīng)?。
樣本處理?：避免溶血或纖維蛋白干擾，離心去除顆粒物?。
洗滌控制?：推薦自動(dòng)化洗板機(jī)(350μL/孔，震板5秒)，減少背景噪聲?。
通過(guò)規(guī)范操作可顯著提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，避免鉤狀效應(yīng)(高濃度抗原導(dǎo)致假陰性)?。
注：以上資料僅供參考，如需進(jìn)一步了解產(chǎn)品詳情，可參考品牌供應(yīng)商或技術(shù)老師。
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